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第 13 章 固相合成 SPPS：从树脂到冻干

The Super-Peptide Primer · 16

一克司美格鲁肽原料药是怎样被造出来的，每一步花多少钱、卡在哪里，以及为什么这条 60 年前发明的工艺至今仍是多肽产能的物理底座。

13.1 Merrifield 的想法：把分子钉在珠子上

多肽是氨基酸串成的链。把两个氨基酸连起来，需要让一个的羧基和另一个的氨基脱去一分子水，形成肽键。这件事在溶液里做过一百年，问题始终是：每接一个氨基酸就要做一次分离提纯，把没反应完的原料、副产物和目标产物分开。链越长，分离次数越多，累积损失越大。1950 年代 du Vigneaud 合成 9 个氨基酸的催产素拿了诺贝尔奖，靠的正是无数次结晶与柱层析，一个 30 个氨基酸的分子在当时几乎不可能用这种方法做出来。

1963 年，Rockefeller 大学的 Bruce Merrifield 提出一个绕开分离的办法：把第一个氨基酸用共价键固定在不溶于溶剂的聚苯乙烯树脂小球上，然后在这颗小球上一个一个往上接。因为产物始终连着小球，每一步反应结束后只需要用溶剂把小球冲洗一遍，多余的原料与副产物被冲走，产物留在球上。分离被简化成了过滤与洗涤，整个流程可以由机器重复执行。这就是固相多肽合成（solid-phase peptide synthesis，SPPS）。Merrifield 因此获得 1984 年诺贝尔化学奖，而今天的司美格鲁肽（semaglutide）、替尔泊肽（tirzepatide）在原料药环节的化学部分，都建立在这个原理上。

树脂本身是一种交联聚苯乙烯或聚乙二醇接枝的多孔小球，直径 75 到 150 微米，在二甲基甲酰胺（DMF）等溶剂中会溶胀数倍，让试剂能扩散进球内。树脂上带有可断开的"连接臂"（linker），常见的有 Wang 树脂、2-氯三苯甲基（2-CTC）树脂和 Rink 酰胺树脂，分别决定最终产物的 C 端是羧酸还是酰胺，以及切割条件的温和程度。"载量"是另一个关键参数，指每克树脂能挂多少毫摩尔的起始氨基酸，商业生产常用 0.3 到 0.6 mmol/g。载量太高，链与链之间会拥挤、聚集，长链合成会失败；载量太低，反应器里装的树脂大部分是没用的塑料。

这里要先建立一个直觉：固相合成的产能不是以"反应器体积"简单计量的，而是"树脂溶胀体积加溶剂"的体积。一个 1,000 升的固相反应器，装填的树脂通常只有 40 到 80 千克，产出的粗肽在几公斤到二十几公斤量级。这就是为什么全球固相合成反应器总体积以"万升"计，而全球每年 GLP-1 类原料药产量以"吨"计，两个数字并不矛盾。

13.2 Fmoc 化学：保护、脱保护、偶联的循环

氨基酸是双头的分子，一头氨基一头羧基，侧链上还可能带着额外的氨基、羧基、羟基或巯基。如果不加控制地让它们反应，会得到杂乱的聚合物。因此固相合成的每一个氨基酸进料时都要先"戴帽子"：α 位氨基戴一个临时保护基，侧链活性基团戴一个更牢固的永久保护基。合成过程就是反复摘掉临时帽子、接上下一个戴帽子的氨基酸，直到链长够了，再一次性摘掉所有永久帽子。

Merrifield 最初用的临时保护基是 Boc（叔丁氧羰基），需要用三氟乙酸这样的强酸摘除，永久保护基则要用更强的氢氟酸切掉，操作危险，设备昂贵。1970 年代 Carpino 发明的 Fmoc（9-芴甲氧羰基）改变了格局：Fmoc 在温和的碱性条件下就能脱除，通常用 20% 哌啶的 DMF 溶液处理几分钟，而侧链保护基（如 tBu、Trt、Pbf、Boc）对碱稳定，只在最后用三氟乙酸切除。酸碱"正交"让两类保护基互不干扰，今天工业上 95% 以上的多肽合成用 Fmoc 化学。芴环在紫外区有强吸收，脱保护液的紫外读数还能实时告诉操作者这一步是否完成。

一个完整的 Fmoc 循环包含四个动作。第一步脱保护：哌啶溶液摘掉树脂上末端氨基酸的 Fmoc。第二步洗涤：用 DMF 冲洗 5 到 10 次，把哌啶和脱下来的芴衍生物冲干净，残留的碱会毁掉下一步。第三步偶联：把下一个 Fmoc 氨基酸用"活化试剂"变成高活性的酯，注入反应器与树脂上的自由氨基反应。常用活化体系是 HBTU、HATU 这类脲盐加碱，或成本更低的 DIC 加 Oxyma。工业上氨基酸通常过量 1.5 到 3 倍，反应 30 到 120 分钟。第四步再洗涤。一个氨基酸一个循环，司美格鲁肽 31 个残基要循环 30 次左右，替尔泊肽 39 个残基要近 40 次。

把这个循环放到一个工业批次里，量级会更直观。下表是一个 1,000 升固相反应器合成司美格鲁肽主链一批的物料清单估算，按树脂载量 0.5 mmol/g、装填 60 千克树脂、氨基酸过量 2 倍、每步洗涤 6 次计算。数字为估算，各企业工艺差异很大。

项目数量（估算）说明
树脂60 千克溶胀后占据 300 到 400 升
Fmoc 保护氨基酸30 个品种，合计约 60 到 80 千克含 Aib 与带侧链构件的赖氨酸
活化试剂与碱约 50 千克DIC/Oxyma 或 HATU 体系
DMF约 40,000 到 60,000 升洗涤占八成以上
哌啶约 4,000 升（20% 溶液计）脱保护
反应器占用时间6 到 10 天30 个循环加装填与卸料
粗肽产出约 15 到 25 千克纯度 50% 到 75%
最终原料药约 6 到 12 千克经两轮 HPLC 与冻干后

从这张表能看出两件事。一是溶剂体积是产物质量的几千倍，这就是下文第 13.7 节要讨论的环保与成本问题的来源。二是从 60 千克树脂到不足 10 千克原料药，反应器一次占用一到两周，一座工厂一年能做的批次是可以数出来的，这决定了"产能以吨计"的行业为什么会被"反应器以万升计"的设备卡住。

循环的效率决定一切。假设每一步偶联和脱保护的效率都是 99%，31 步之后目标序列在所有链中的占比大约是 0.99 的 62 次方，约 54%；如果单步效率掉到 98%，占比就落到 29%。差 1 个百分点，粗品纯度差一倍，下游纯化的负担也差一倍。工业工艺化学家的核心工作，是把每一步逼近 99.5% 以上，并识别"困难序列"，即链上容易形成 β 折叠聚集导致反应不完全的片段。对付聚集的办法包括在特定位置引入伪脯氨酸二肽、提高温度、换用极性更强的溶剂，或者把长链拆成两三段分别合成再在溶液中拼接。

GLP-1 类分子还有两个特殊的化学任务。一是非天然氨基酸：司美格鲁肽和替尔泊肽的第 2 位（以及替尔泊肽第 13 位）用 α-氨基异丁酸（Aib）替代天然的丙氨酸，以抵抗 DPP-4 酶的降解。Aib 在 α 碳上有两个甲基，空间位阻大，偶联慢且容易不完全，需要更强的活化试剂和更长时间。二是脂肪酸侧链：司美格鲁肽第 26 位赖氨酸的侧链上挂着一条由两个 OEG 短链、一个 γ-谷氨酸和一条 C18 二酸组成的"尾巴"，替尔泊肽在第 20 位挂 C20 二酸。这条尾巴让分子与血液中的白蛋白结合，把半衰期从几分钟延长到一周。工业上的做法是给那个赖氨酸戴一个与其他侧链保护基不同的第三种"帽子"（如 Alloc 或 ivDde），主链装完后单独摘掉它，再分步把尾巴的每一段接上去，或者直接购买预先组装好的"赖氨酸加尾巴"复合构件。这类构件每千克数万到十几万元人民币，是原料成本里最贵的一项。

13.3 切割：把成品从珠子上剪下来

链装完，所有残基仍然戴着侧链保护基并挂在树脂上。切割（cleavage）一步同时解决两件事：用三氟乙酸把肽从树脂连接臂上断开，并把 tBu、Trt、Pbf 等侧链保护基全部摘掉。三氟乙酸浓度通常在 90% 到 95%，配以少量水、三异丙基硅烷（TIS）、二硫醇类等"清除剂"，用于捕捉摘下来的碳正离子，否则它们会回头攻击色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸等敏感残基，生成难以分离的杂质。切割时间 2 到 4 小时，温度控制在室温附近。

切割液随后被浓缩，再倒入大量冷的乙醚或甲基叔丁基醚中。多肽不溶于醚，会以絮状沉淀析出，过滤、洗涤、干燥后得到"粗肽"。工业级 GLP-1 粗肽的纯度通常在 50% 到 75% 之间，其余是缺失一个残基的"缺失序列"、多接了一个残基的插入序列、氧化产物、消旋异构体、以及未完全脱除保护基的分子。这些杂质和目标产物只差一个氨基酸、一个甲基或一个氧原子，物理化学性质极其接近。粗肽的纯度直接决定下游纯化的成本，也是为什么"合成"环节看起来结束了，真正的难题才刚开始。

粗肽纯度的差距也是企业之间的差距。同一个司美格鲁肽序列，成熟 CDMO 的粗肽纯度可以稳定在 70% 以上，新进入者的首批往往只有 50% 上下。差别来自树脂批次一致性、氨基酸原料中微量的消旋体与游离胺、洗涤是否彻底、以及对困难序列位置是否做了预处理。20 个百分点的粗品纯度差，会在纯化环节放大为一倍的色谱轮次与一半的回收率损失，最终体现为每克成本的两三倍差异。

切割步骤的规模效应有限，因为三氟乙酸腐蚀性强、挥发性大，每批处理量受制于防腐反应器与废酸处理能力。中国 2024 到 2026 年多肽原料药产能扩张中，环评审批耗时最长的环节之一正是含氟废酸的处理配套。

13.4 纯化：HPLC 是真正的瓶颈

从 60% 纯度的粗肽到 99% 以上、单一杂质低于 0.5% 的原料药，靠的是制备型反相高效液相色谱（RP-HPLC）。原理是把粗肽溶液泵入装填了十几微米硅胶微球（表面键合 C8 或 C18 烷基链）的钢柱，再用水和乙腈按梯度混合的流动相冲洗。不同分子按疏水性强弱先后被冲出，用紫外检测器分段收集，只保留目标峰。工业色谱柱直径 30 到 60 厘米，长 25 到 50 厘米，一根柱子的填料价值数百万元人民币，寿命几十到几百次运行。

纯化难在四个数字。第一是载量，一根柱子每次只能上样填料质量的 1% 到 2%，一根 60 厘米柱每轮处理几百克粗肽。第二是回收率，为了把纯度做到 99%，主峰两侧含杂质的部分要切掉，单次回收率常在 60% 到 80%，多数 GLP-1 工艺需要两轮不同 pH 或不同流动相体系的色谱，累积回收率降到 50% 到 65%。第三是时间，一轮制备色谱连带上样、梯度、再生要 2 到 4 小时，一吨级原料药一年需要上千轮。第四是溶剂，乙腈与水的用量是粗肽质量的数千倍，回收乙腈的蒸馏系统本身就是一项重要投资。

纯化之后还有一步"盐交换"。色谱流动相里的三氟乙酸会以反离子形式留在产物上，而药典要求原料药以乙酸盐或钠盐形式存在。做法是最后一轮色谱改用含乙酸铵或乙酸的流动相，或者通过离子交换树脂置换，之后再经过超滤浓缩除掉多余的小分子。这一步同样有时间与回收率损失。

纯化的目标由质量标准倒推。多肽原料药的杂质控制遵循 ICH Q3 系列指南与药典专论，通行做法是总纯度不低于 98.5% 到 99%，任何单一已鉴定杂质不高于 0.5%，未鉴定杂质不高于 0.1% 到 0.2%，并对消旋异构体、氧化产物、脱酰胺产物逐一设限。这意味着分析方法本身要能分辨只差一个氧原子的两个 4,000 道尔顿分子，工业上依赖超高效液相色谱联用高分辨质谱，一个品种的方法开发与验证需要半年到一年。一份能通过 FDA 审评的 DMF，杂质谱研究部分常常比工艺描述部分厚得多。

把上述数字放在一起就明白为什么业界常说"合成是把粗肽做出来，纯化是把钱花出去"。PolyPeptide 与 Bachem 在 2025 到 2026 年的扩产公告里，新增"HPLC 纯化列"的次数不亚于新增固相反应器，Bachem 在 Sisseln 园区第二期 2.8 亿瑞郎投资中明确写入了"额外的 HPLC 纯化列"。中国多家企业 2024 年一度出现固相反应器建好而色谱产能不足、粗肽积压的情况，也印证了瓶颈所在。

13.5 冻干：把水拿走并留下可称量的粉

纯化得到的是一大桶稀溶液，多肽浓度只有百分之几，其余是水和残留乙腈。最后一步是把它变成可以称重、可以长期保存、可以运往制剂厂的粉末。多肽对热敏感，不能像小分子那样蒸干或喷雾干燥，工业上普遍采用冷冻干燥，即冻干（lyophilization）。

冻干分三段。先把溶液在托盘或瓶中冷冻到零下 40 摄氏度以下，让水全部结成冰，多肽被固定在冰的骨架间隙里。然后抽真空到 0.1 毫巴量级，同时给搁板轻微加热，让冰不经过液态直接升华为水蒸气，被冷凝器捕获，这是"一次干燥"，占整个周期的大部分时间。最后适度升温做"二次干燥"，脱除吸附在分子表面的结合水，把残留水分降到 5% 以下。整个周期 2 到 5 天，产物是蓬松的白色粉末，即最终原料药。

冻干的产能约束来自三方面。一是设备，一台 50 平方米搁板面积的工业冻干机造价数千万元人民币，交付周期 18 到 24 个月，Lonza 2026 年 2 月宣布的 Visp 扩产里专门配了"5 万升冻干能力"的独立套间，说明 CDMO 已经把冻干视作与固相反应器同等级的产能单元。二是时间，一批原料药要在冻干机里占用几天，冻干机数量直接限制年产批次。三是工程经验，冻干曲线（温度、真空、时间的组合）要针对每个分子反复摸索，曲线不对会导致粉末塌陷、残留溶剂超标或活性损失，这是本书所说"工艺人才"的典型体现。

为什么不用更快、更便宜的喷雾干燥？小分子原料药与部分蛋白制剂确实用喷雾干燥，把溶液雾化到热气流中几秒钟内蒸干。多肽原料药很少这样做，原因有三。一是热应力，出口温度即便控制在 60 到 80 摄氏度，对含甲硫氨酸、色氨酸的序列也会带来氧化与消旋风险。二是粉体形态，喷雾干燥得到的致密微球复溶速度与冻干的疏松饼状粉末不同，而后续制剂灌装工艺是按冻干粉的复溶特性验证的，改工艺意味着重做稳定性研究。三是监管惯性，几乎所有已获批 GLP-1 类原料药的 DMF 都以冻干为最终步骤，换路线要重新申报。2025 年起有 CDMO 在探索连续冻干与可控成核技术把周期从数天缩到一天以内，但尚未进入商业化原料药生产。

多肽原料药在 GLP-1 类药物的最终成本中占比其实不高。以司美格鲁肽为例，每支注射笔含药 1 到 2.4 毫克，按原料药每克数千美元计，药物成本在每支几美元到十几美元之间，远低于注射笔、无菌灌装与销售费用。这解释了一个看似矛盾的现象：2024 到 2025 年 GLP-1 供应短缺的直接瓶颈是无菌灌装线，而不是原料药，但原料药的长期供需仍然紧张，因为它的产能建设周期最长、工艺壁垒最高，且新一代多靶点分子对它的需求只增不减。

13.6 每一步的成本占比与瓶颈

下表把一克 GLP-1 类原料药的成本拆到各步骤。数字是根据公开的技术经济分析（如 Intelligen 公司 2025 年发表的司美格鲁肽 SuperPro 模型：一座年产 500 千克纯品的概念工厂，单位成本约 10.55 万美元每千克，即约 105 美元每克）、CDMO 公开的扩产结构，以及行业访谈整理的区间，属于估算，不同分子、不同规模、不同地区会有显著差异。

步骤成本占比（估算）主要成本项核心瓶颈
树脂与保护氨基酸20% 到 30%Fmoc 氨基酸、Aib、脂肪酸侧链构件、树脂非天然构件供应商少，价格波动大
偶联与脱保护10% 到 15%DMF 与哌啶、活化试剂、反应器工时困难序列、单步效率、反应器交付 14 到 22 个月
切割与沉淀5% 左右三氟乙酸、清除剂、废酸处理环保审批、防腐设备
HPLC 纯化与盐交换30% 到 40%色谱填料、乙腈、柱工时、回收率损失载量与回收率、填料寿命、乙腈回收
冻干5% 到 10%设备折旧、能耗、周期占用冻干机交付 18 到 24 个月、曲线开发
质控、放行与合规10% 到 15%杂质谱分析、稳定性、cGMP 体系QA/QC 人才、监管检查

三个观察值得展开。第一，原料与纯化两项合计占六成以上，这两项都随规模下降但不会消失，这是中国企业成本能比欧美低 30% 到 50% 的来源：保护氨基酸、树脂、色谱填料的本土化，加上人工与能耗更低。第二，反应器与冻干机的"时间成本"没有出现在直接成本里，却决定了谁能在 2027 到 2029 年拿到订单。2026 年全球 SPPS 产能利用率估计在 87% 到 91%，远高于 70% 到 75% 的可持续水平。第三，质控与合规是"看不见"的成本，一个原料药的美国 DMF 备案、一次 FDA 现场检查，涉及的分析方法开发与数据完整性投入往往超过设备本身，而这恰恰是 AGI 短期内难以替代的部分。

成本会怎样变化，可以做一个简单推演。如果中国企业把保护氨基酸与树脂完全本土化并把纯化回收率从 55% 提到 70%，同时规模从年产百公斤级升到吨级，司美格鲁肽原料药的完全成本有可能从 2024 年的每克数千元人民币降到每克数百元。这与第 18 章讨论的价格战直接相关：2026 年 3 月司美格鲁肽中国化合物专利到期后，原料药价格会沿着这条成本曲线下滑，而成本曲线左端的企业不是反应器最多的，而是原料自供比例最高、纯化回收率最高、批次失败率最低的。反之，如果一家企业只是买了反应器却依赖进口非天然构件与进口色谱填料，它在价格战里没有位置。

13.7 溶剂、绿色化学与新一代工艺

固相合成最大的隐性成本是溶剂。每一步洗涤都在消耗 DMF，一个 30 多个残基的分子要经历数百次洗涤。2026 年 2 月发表在《Nature Sustainability》上的一项研究（墨尔本大学、哥本哈根大学与 SpheriTech 公司合作，作者包括 2022 年诺贝尔化学奖得主 Morten Meldal）给出的数字是：生产 1 千克 GLP-1 受体激动剂需要消耗多达 14,000 千克有机溶剂，主要是 DMF，而典型小分子药物每千克只需要约 300 千克。按全球司美格鲁肽年产量接近 4,000 千克估算，仅这一个分子每年产生约 5,600 万千克溶剂废物。行业综述给出的范围更宽，每千克原料药 3,000 到 15,000 千克废物，其中 DMF 占大多数。

DMF 还有监管问题。它被欧盟列为生殖毒性物质，REACH 法规自 2023 年 12 月起限制其工作场所暴露水平，欧洲工厂为此投入大量通风与密闭改造。替代溶剂的探索因此加速：N-丁基吡咯烷酮（NBP）、2-甲基四氢呋喃、二甲基亚砜与乙酸丁酯的二元混合物、以及乙酸乙酯体系都有工业验证案例，2025 年一篇利拉鲁肽（liraglutide）的研究展示了完全不用 DMF 的固相合成路线，采用 1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺做偶联并结合"捕获释放"纯化。上文提到的 2026 年水相合成研究则更进一步：研究者发现 Fmoc 氨基酸与特定盐配对后可溶于水，配合水溶性活化剂和可生物降解的亲水固相载体，实现了完全在水中进行的固相合成，三个高难度肽的产率与纯度不低于传统方法，尚待在自动化与更长序列上验证。

减少洗涤次数是另一条路。2023 年发表在《Nature Communications》上的"全洗涤消除"方法，把脱保护后的哌啶和芴副产物在升温下直接蒸发而不再用溶剂冲洗，报告溶剂废物减少 90% 以上。这类方法在研究级合成仪上已经商业化，工业放大受限于大反应器内部传热与蒸发均匀性。

微波合成是过去 15 年的另一项改进。CEM 公司的 Liberty 系列合成仪用微波把反应体系快速加热到 75 到 90 摄氏度，使偶联和脱保护从几十分钟缩短到几分钟，对 Aib 这类位阻大的残基和聚集倾向强的困难序列尤其有效。它在克级到百克级的研发与临床早期供应中已是主流，但吨级生产上微波穿透距离有限、大体积均匀加热困难，工业界更多采用传统夹套加热到 40 到 60 摄氏度的"温和升温"方案来获得部分好处。

连续流合成则是把树脂装入柱子而不是搅拌罐，让试剂连续流过。MIT 的 Pentelute 实验室 2020 年在《Science》上展示了自动化快速流动化学连续 327 步反应合成 164 个残基的蛋白，每步只需数十秒。流动模式的优点是反应速度快、可实时监测、溶剂与试剂用量更精准，缺点是树脂在柱中的背压和溶胀限制了单柱规模，目前商业上以 Vapourtec 等公司的百克级设备为主。PolyPeptide 在 Strasbourg 的 1.8 亿美元扩产计划明确写入"连续生产基础设施"，是大型 CDMO 首次把连续流列入商业产能规划，但要到 2027 年之后才能验证经济性。

还有一条容易被忽视的路线是液相与固相的杂合。Bachem 的"分子蜂巢"（Molecular Hiving）技术把一个大体积的疏水标签接在肽链末端，使中间体在溶液中反应、通过沉淀而不是色谱分离，试图把固相合成的操作简便性与液相合成的规模优势结合。多家 CDMO 与中国企业采用的"片段缩合"路线也属于这一类：把 30 多个残基拆成 2 到 3 个片段分别在固相上合成，切下后在溶液中拼接，好处是每个片段更短、单步效率更高、粗品更纯，代价是多了一步液相偶联及其纯化。替尔泊肽的公开工艺文献描述的正是固相片段加液相缩合的杂合路线，第 14 章会与重组路线一起比较。

把这些新工艺放到本书框架下看：AI 已经能预测困难序列、优化偶联条件、设计更高效的活化试剂与新型固相载体，这些属于"设计层"，会随算力变便宜。但溶剂回收塔、防腐切割反应器、60 厘米色谱柱和 50 平方米冻干机是钢铁与不锈钢，它们的交付周期、环评审批和运行经验不会因为智力变成 1000 而缩短。绿色化学能把每千克原料药的溶剂从 14,000 千克降到几千千克，能把欧洲工厂的合规成本降下来，但不能消除物理产能这一稀缺性本身。

本章要点

与定位的关系

对资本而言，本章给出的成本结构说明多肽原料药的护城河不在"会不会合成"，而在纯化回收率、溶剂回收、冻干工程和质量体系这些累积性的工艺细节上。判断一家原料药或 CDMO 公司时，应看它的色谱柱数量与冻干面积是否与固相反应器体积匹配，看它的 DMF 用量与回收率，看它有多少非天然构件的自供能力，而不只是看"多少升反应器"。把这几项与第 15 章、第 16 章的公司表对照，能识别出哪些产能是真实的、哪些只是钢罐。

对事业而言，本章描述的每一个环节都是一个岗位。工艺化学家决定单步效率，色谱工程师决定回收率，冻干工程师决定批次成败，QA 人员决定 DMF 能否通过 FDA 检查。这些岗位的共同点是知识来自失败批次的积累，短期内无法被生成模型替代，反而会因为 AI 设计出更多含非天然构件的复杂分子而更加稀缺。懂 AI 序列设计、又亲手放大过 100 升以上固相合成的人，是全球范围内以百计的群体。

对个人而言，理解合成与纯化的难度有一个直接用途：它解释了为什么研究级或灰色市场多肽的杂质风险真实存在。一个 60% 纯度的粗肽与一个 99% 纯度的原料药之间隔着本章第 13.4 节的全部内容，而没有 cGMP 体系的作坊不会做这些工作。本书不构成医疗建议，但本章的化学至少说明了"多肽粉末"三个字之下的差别有多大。

资料来源

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