第 14 章重组表达与化学酶法：路线之争

同样是造一个 GLP-1 类分子，诺和诺德让酵母长出来，礼来用化学一个个接起来，两条路线的成本、速度与灵活性差在哪里，酶法与杂合路线又会把胜负带向何方。

14.1 两条路线在做同一件事

多肽是氨基酸按固定顺序连成的链。要得到这条链，有两种根本不同的办法。化学法在第 13 章讲过：在树脂上一个一个接氨基酸，人来当"排字工"。生物法则把编码这条链的 DNA 塞进细菌或酵母，让细胞的核糖体按 DNA 指令自己合成，人只负责养细胞、收产物、切下想要的片段。前者叫化学合成，后者叫重组表达（recombinant expression），"重组"指把外源基因拼进宿主细胞的基因组或质粒。

重组法的历史比 GLP-1 更早。1982 年礼来（Eli Lilly）上市的 Humulin 是第一个重组人胰岛素，用大肠杆菌表达，此前胰岛素来自猪和牛的胰腺，每 10 千克胰腺才提取约 1 克。诺和诺德（Novo Nordisk）随后以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）建立了自己的胰岛素表达体系，酵母能把产物分泌到培养液中并正确形成二硫键，省去了大肠杆菌路线中打破细胞、重折叠包涵体的步骤。四十年后，诺和诺德的利拉鲁肽（liraglutide）与司美格鲁肽（semaglutide）主链仍然长在酵母里，这套体系的沉没成本与工艺知识是它选择路线的根本原因。

在生物法内部，宿主的选择本身就是一场路线之争。大肠杆菌生长快、基因操作简单、培养基最便宜，一天一代可以做到极高的细胞密度，但短肽在大肠杆菌胞内容易被自身蛋白酶降解，通常要把目标肽与一个大的载体蛋白融合表达成不溶的包涵体，收获后打破细胞、溶解包涵体、切下目标肽并重折叠，下游步骤多、收率损失大。酵母的优点是能把产物分泌到细胞外的培养液里，收获时只需分离上清，二硫键在分泌途径中自然形成，杂质谱也更干净，代价是表达量偏低、发酵周期更长。礼来的胰岛素与利拉鲁肽的化学法竞争者不同，礼来的胰岛素至今仍用大肠杆菌，诺和诺德用酵母，两家公司四十年没有互换，说明宿主体系一旦与工厂、监管档案和人才绑定，切换成本极高。

有读者会问，合成生物学不是已经能让细胞装入非天然氨基酸了吗。确实，"遗传密码扩展"技术通过改造 tRNA 与合成酶，让终止密码子之一编码一个非天然氨基酸，Ambrx 等公司用它在抗体上定点引入偶联位点。但这项技术能装入的是侧链非天然、主链仍是标准 α 氨基酸骨架的残基，对 Aib 这类 α 碳上两个取代基的分子，核糖体的肽基转移中心几乎无法接受，效率低到没有工业意义。脂肪酸二酸侧链更是完全不在核糖体的能力范围内。所以在可见的将来，GLP-1 类分子的非天然部分仍要靠化学。

两条路线的边界由一个化学事实划定：核糖体只认 20 种天然氨基酸（加硒代半胱氨酸等极少数例外），不能装入 Aib 这类 α 碳双取代的非天然氨基酸，也不能直接接上 C18 脂肪酸尾巴。利拉鲁肽相对简单，它的 31 个残基全部是天然氨基酸，只在第 26 位赖氨酸挂一条 C16 棕榈酸，因此酵母可以表达完整主链，再用一步化学酰化把脂肪酸接上。司美格鲁肽第 2 位是 Aib，酵母做不了，诺和诺德的办法是让酵母表达缺少前几个残基的前体，再用固相合成做一个含 Aib 的短肽片段，最后在溶液中把两者拼接并接上侧链。替尔泊肽（tirzepatide）有两个 Aib、一条 C20 二酸尾巴，并且序列本身是对天然 GIP 大幅改造的人工序列，礼来从一开始就走全化学路线。

14.2 诺和诺德的酵母路线：长出来，再修饰

诺和诺德的司美格鲁肽工艺可以拆成四段。第一段是发酵：携带前体基因的酿酒酵母在大型不锈钢发酵罐中培养，据公开描述，商业规模发酵罐达 2 万升量级，一批发酵加下游处理需要两到三周。酵母把前体肽分泌到培养液中，前体通常带着一段帮助分泌与折叠的"前导序列"，收获后用蛋白酶把前导序列切掉，得到裸的主链片段，再经过多步层析纯化。这一段的技术经济性由"表达量"决定，即每升培养液能产多少克目标肽，酵母表达短肽的表达量通常在每升零点几克到一克多之间，比抗体的哺乳动物细胞低，但培养基便宜、周期短。

第二段是化学合成两个小构件：一个是含 Aib 的 N 端短肽（司美格鲁肽的 His-Aib 二肽或更长的片段，视具体专利路线而定），另一个是完整的侧链，即 OEG-OEG-γGlu-C18 二酸。这两样都在固相或液相上用第 13 章的方法制备，规模小、序列短，纯度容易做高。第三段是缩合：把短肽与酵母前体在溶液中偶联，再把侧链酰化到第 26 位赖氨酸上。这一步要求极高的选择性，因为主链上有多个氨基都可能被酰化，工艺上通过保护基、pH 与试剂比例控制。第四段与化学路线相同：反相 HPLC 纯化、盐交换、冻干。

利拉鲁肽是理解这条路线的更简单的例子。诺和诺德让酵母表达完整的 31 个残基主链（GLP-1 的 7 到 37 位，第 34 位赖氨酸换成精氨酸，使全分子只剩第 26 位一个赖氨酸），纯化后在溶液中用活化的棕榈酰-γ-谷氨酸酯做一步酰化，把脂肪酸接到那个唯一的赖氨酸上。因为只有一个赖氨酸和一个 N 端氨基可以被酰化，选择性问题比司美格鲁肽小得多，只需控制 pH 让 N 端氨基质子化而不反应。这一步"表达完整主链，再做一步化学修饰"的模式，是诺和诺德随后设计司美格鲁肽、cagrilintide 等分子时始终考虑的制造约束，也是它与礼来在分子设计哲学上的一个根本差异：诺和诺德倾向于在天然序列上做最少的必要改动，礼来则接受高度人工化的序列。

原料药生产集中在丹麦 Kalundborg，那里是诺和诺德全球最大的原料药基地，2023 年宣布追加 420 亿丹麦克朗（约 60 亿美元）扩建。2024 年诺和诺德的控股股东以 165 亿美元收购 CDMO 公司 Catalent，再把其中三座灌装工厂转给诺和诺德，目的是解决无菌灌装而不是原料药的瓶颈。这个事实反过来印证了酵母路线在原料药端的产量是够的。

这条路线的优点是主链部分成本极低。发酵罐的单位容积造价远低于固相反应器，培养基是糖、盐和酵母提取物，不消耗 DMF 和昂贵的保护氨基酸，一批产出以几十千克计。Intelligen 公司 2025 年发表的一份技术经济模型（用 SuperPro Designer 软件建模一座年产 500 千克司美格鲁肽纯品的概念工厂，采用酵母前体加固相片段加缩合的杂合路线）给出的单位成本约为 10.55 万美元每千克，即约 105 美元每克。这是学术模型而非诺和诺德的真实成本，但量级可作参考。

缺点有三。一是灵活性差：每换一个分子就要重新构建菌株、重新做发酵放大与病毒安全性评估，从菌株到商业批需要两到三年，而化学路线换分子只需换进料程序。二是杂质谱不同：发酵带来宿主蛋白、DNA 残留、蛋白酶降解片段等生物源杂质，需要额外的清除验证。三是前体与化学片段的拼接是一个低容错步骤，缩合效率与选择性问题会直接损失最贵的中间体。诺和诺德在 2023 到 2025 年的供应短缺，瓶颈主要在无菌灌装而非原料药，说明这条路线的原料药产量本身是充足的。

14.3 礼来的化学路线：一个一个接，再拆成片段拼

替尔泊肽 39 个残基，第 2 位与第 13 位是 Aib，第 20 位赖氨酸上是 C20 二酸经 γGlu 与两个 OEG 连接的侧链，C 端是酰胺。这个分子对重组法关上了门，礼来选择全化学合成。礼来工艺化学团队公开发表的工艺文献描述的是一条"杂合固相合成"路线：把主链拆成两个或三个片段分别在树脂上用 Fmoc 化学合成，切下保护片段后在溶液中缩合成全长，再脱保护、纯化、冻干。拆片段的逻辑在第 13 章提过，短片段单步效率更高、粗品更纯，缩合虽然多一步，但整体收率与纯度好于一次做完 39 步。

礼来路线的成本主要由三样东西决定：Fmoc 保护氨基酸（特别是 Aib 与预装侧链的赖氨酸构件）、溶剂与色谱、以及固相反应器的占用时间。它的优势是可预测：化学过程不会像细胞那样"生病"，批次间一致性高，放大是工程问题而不是生物学问题。它的另一个优势是平台性：替尔泊肽、瑞他鲁肽（retatrutide）以及礼来资助的五靶点激动剂可以共用同一套反应器、同一批供应商、同一套分析平台，分子换了，设备不换。这也是礼来能在 2024 到 2026 年把多靶点管线快速推进到三期的制造层面原因。

礼来为此投入的资本规模是行业内最大的。仅印第安纳州 Lebanon 的原料药工厂，2024 年在原有 37 亿美元基础上追加 53 亿美元，总投资约 90 亿美元，用于替尔泊肽与后续分子的原料药生产；威斯康星州 Kenosha 追加 30 亿美元用于注射剂灌装。礼来公开表示自 2020 年以来在美国制造上的承诺累计超过 500 亿美元（该数字为礼来 2025 年公告口径，各项目进度不同）。这些投资的相当部分是固相反应器、色谱与冻干，与 CDMO 的扩产在争夺同样的设备供应商与同样的工艺人才。

路线选择还有一个监管维度，对中国企业尤其重要。在美国，40 个氨基酸以下的多肽按化学药（新药申请 NDA）而非生物制品（BLA）监管，司美格鲁肽、利拉鲁肽的原研批文都是 NDA。这带来一个问题：原研用重组法生产，仿制者用化学法生产，两者杂质谱不同，化学法产品能否走简化新药申请（ANDA）的仿制路径。FDA 在 2021 年发布的指南《参照重组来源上市药物的高纯度合成多肽 ANDA》给出了肯定答案，条件是合成产品中任何原研没有的新杂质不得超过 0.5%，并需评估这些杂质的免疫原性风险。这份指南是翰宇药业的利拉鲁肽注射液能在 2024 年 12 月以化学法获得 FDA 首仿批准的法律基础，也是圣诺生物、诺泰生物等中国企业以化学法司美格鲁肽原料药做美国 DMF 备案的前提。欧洲药典与中国药典随后采用了类似思路。换句话说，监管已经承认两条路线可以做出"同一个药"，竞争回到成本与杂质控制本身。

化学路线的劣势同样清楚。每千克原料药消耗数千到上万千克溶剂（见第 13 章），单位成本对保护氨基酸价格敏感，且原料药产能建设周期 18 到 36 个月。礼来 2024 年以来将部分原料药外包给 CordenPharma、Bachem 等 CDMO，并投资自建，正是因为化学路线产能建设的时间无法被资金直接买短。

14.4 成本对比：化学法与生物法各自的算术

下表比较两条路线在 GLP-1 类分子上的关键经济参数。数字综合公开技术经济模型、CDMO 公告与行业访谈，属于区间估算；两家公司的真实成本未公开。

维度	酵母重组加化学修饰（诺和诺德）	全化学固相加片段缩合（礼来）
适用分子	主链为天然氨基酸，非天然部分少且集中	任意序列，含多个 Aib、D 型氨基酸、多条侧链
主链原料成本	极低，培养基为糖与盐	高，Fmoc 氨基酸占成本 20% 到 30%
溶剂消耗	每千克数百至一千余千克，以水为主	每千克数千至 14,000 千克，以 DMF 为主
单批产出	数十千克前体	6 到 25 千克原料药（1,000 升反应器）
换分子的准备期	24 到 36 个月（菌株、发酵放大、生物安全）	6 到 12 个月（进料程序、片段划分）
单位成本（估算）	约 100 美元每克量级（500 千克每年模型）	约 150 到 400 美元每克（欧美 CDMO 报价区间）
主要杂质	宿主蛋白、降解片段、缩合副产物	缺失序列、消旋体、氧化产物
产能建设周期	发酵罐较快，纯化与冻干同样 18 到 24 个月	反应器与冻干 18 到 36 个月

把每克成本换算到一支注射笔上，更能看清路线之争在商业上的分量。以司美格鲁肽减重剂型的最高剂量每周 2.4 毫克计，一个月用药约 10 毫克，按原料药每克 100 到 400 美元计，一个月的原料药成本在 1 到 4 美元之间，而美国市场每月标价曾超过 1,000 美元，2027 年降价后仍在 500 美元左右。原料药成本占比不到 1%。替尔泊肽最高剂量每周 15 毫克，月用量约 65 毫克，原料药成本约 10 到 25 美元，占比仍然很低。这说明路线之争对原研利润的影响很小，但对仿制药与原料药供应商是生死问题：当中国市场的司美格鲁肽制剂价格在专利到期后跌到每月一两百元人民币时，每克原料药几百元与一千多元的差别就是全部利润。

三点解读。第一，生物法的成本优势主要体现在主链上，而司美格鲁肽的总成本里主链只是一部分，侧链构件、缩合、纯化与冻干是两条路线共有的。所以两者的最终单位成本差距并没有"发酵对合成"这个对比暗示的那么大，估计在 1.5 到 3 倍之间，且随化学路线规模放大而缩小。第二，中国企业几乎全部采用化学路线仿制司美格鲁肽，原因不是生物法不好，而是化学法无需重建菌株、可以直接沿用现有固相产能，并且以化学仿制药（中国注册分类 4 类）而非生物类似药申报的路径更成熟。九源基因是少数以"生物类似药"路径申报的公司，它的司美格鲁肽用重组路线。第三，生物法真正的护城河不在成本，而在监管：一个重组前体的菌株、发酵与病毒清除数据构成一整套难以复制的档案，仿制者要么重建，要么改走化学路线接受更高的原料成本。

14.5 化学酶法与杂合路线：第三条路

化学法与生物法之间有一条正在成型的中间路线，用酶来完成化学法做不好的步骤，用化学来完成酶做不了的步骤。核心工具是"连接酶"（ligase）：一类被改造过的蛋白酶，正常蛋白酶切肽键，改造后的酶在特定条件下反过来把两个肽片段连成一个。荷兰 EnzyTag 公司（源自 DSM 的技术）开发的 omniligase 是这一类的代表，它对连接位点的序列要求宽松，可以在水相、室温、几乎无保护基的条件下把两个 10 到 20 个残基的片段拼成全长，从而绕开化学缩合中的消旋、溶剂与保护基问题。这条"化学酶法多肽合成"（CEPS）路线的逻辑是：短片段用固相合成，粗品纯度高、成本低；拼接用酶，选择性高、不用 DMF；只在最后做一次纯化。

酶在多肽制造里的历史其实很长。1980 年代礼来与诺和诺德把猪胰岛素转化为人胰岛素用的就是胰蛋白酶催化的转肽反应，替换 B 链末端一个氨基酸；今天诺和诺德的司美格鲁肽前体也依赖蛋白酶切除前导序列。新的变化是酶本身可以被设计：定向进化与 AI 辅助的蛋白设计已经能在几个月内改造一个连接酶的底物特异性，让它接受 Aib 相邻位点或带侧链的赖氨酸。这一点把"设计层"的进步直接引入了制造环节。

一个已经商业化的酶法案例是诺和诺德的速效胰岛素类似物工艺：酵母表达单链前体，用赖氨酸特异性蛋白酶切除连接肽，再用胰蛋白酶在有机溶剂与水的混合体系中把 B 链末端的苏氨酸酯接回去，随后水解酯基。这个转肽步骤在数十年里一直以吨级规模运行，收率超过 90%，证明酶催化的肽键形成在 GMP 条件下完全可以稳定放大。它没有被推广到 GLP-1 类分子，只是因为诺和诺德的 GLP-1 分子被设计成不需要它。

酶法的经济性取决于三个数字：酶的成本、连接效率、以及连接位点的通用性。2026 年商业连接酶的价格大约在每克数百到上千美元，一个 10 千克批次所需酶量在数十克量级，酶成本占比可控。连接效率在优化后能到 80% 到 95%。通用性是最大障碍，天然来源的连接酶对连接位点两侧各两三个残基有偏好，AI 辅助的酶设计正是在这一点上发力：给定目标序列的一个切分点，用蛋白语言模型与结构预测生成候选酶变体，湿实验筛选后几个月内拿到专用酶。这与第 11 章描述的从头设计能力属于同一套工具。

读者可能听说过 Codexis 公司的 ECO 合成平台，需要澄清的是它面向的是寡核苷酸（siRNA 等 RNA 药物），用聚合酶与连接酶替代固相寡核苷酸合成，Codexis 公开的数据是单次反应规模超过 10 千克并实现水相无有机溶剂工艺。它对多肽领域的意义是示范：一个同样依赖固相合成、同样被溶剂与规模困住的分子类别，酶法能够走到 GMP 技术转移阶段，那么多肽的酶法连接走通同样的路只是时间问题。但截至 2026 年，酶法多肽连接尚无已获批的商业化 GLP-1 类原料药采用，主要停留在临床供应与工艺验证阶段。

杂合路线的另一个方向是"重组片段加化学片段"，即诺和诺德司美格鲁肽路线的一般化：把序列中天然氨基酸连续的长段交给酵母或大肠杆菌，把含非天然氨基酸的短段交给化学，用酶或化学缩合拼接。对瑞他鲁肽这类含多个非天然位点、序列高度人工化的分子，可拆出的天然长段不多，杂合的收益有限。对 amycretin、cagrilintide 这类胰淀素类似物，以及未来可能出现的更长的迷你蛋白，杂合路线的价值会更大。

下表汇总三条路线在几个关键方面的比较。

路线	非天然氨基酸	溶剂与环保	规模优势	成熟度（2026 年）
全化学固相	任意	差，DMF 为主	中，受反应器限制	商业化主流
重组加化学修饰	仅限末端或侧链	好，主链水相	高，发酵罐易放大	商业化，诺和诺德
化学酶法连接	片段内任意	较好，连接步骤水相	中到高	临床供应、验证中
重组片段加化学片段	集中于短段	较好	高	个案，如司美格鲁肽

14.6 AGI 时代哪条路线占优

这一节是推演，前提写明。基准线情景假设：到 2030 年，AI 设计使新的多靶点分子中非天然氨基酸与化学修饰的比例进一步上升，同时酶的设计成本下降一个量级，重组表达的宿主工程也因 AI 而缩短周期。

第一个推论：设计自由度上升对化学法有利。如果未来五年的主流分子是瑞他鲁肽式的三靶点、礼来资助的五靶点、以及带两条侧链或环化结构的分子，那么每一个新分子都有多个核糖体做不了的位点，全化学或以化学为主的杂合路线是默认选项。这解释了为什么 2026 年全球 CDMO 超过 24 亿美元的新增投资几乎全部投向固相合成与配套纯化、冻干，而不是发酵罐。

第二个推论：酶法是设计层向制造层渗透的通道，会成为化学法的补丁而不是替代。AI 能在几周内给出一个针对特定连接位点的连接酶序列，这使"每个分子配一个专属连接酶"在经济上变得可行。到 2030 年前后，长于 40 个残基的分子很可能普遍采用"固相片段加酶法连接"，把 DMF 用量降低一半以上、把最长片段控制在 20 个残基以内。但连接完的全长分子仍然需要 HPLC 纯化与冻干，第 13 章描述的两个最大瓶颈没有被绕开。

第三个推论：如果本书的思想实验成立，寿命趋近 1000 岁、多肽从"治疗"变为终身"维护"耗材，年需求量从吨级走向数十吨到百吨级，那么重组路线的规模优势会重新变得重要。发酵罐从 2 万升放大到 20 万升的工程比把固相反应器从 1,000 升放大到 1 万升容易得多，也不带来溶剂问题。在那个世界里，最可能的产业形态是：分子设计时就把"可重组表达的天然长段"作为约束条件之一写进目标函数，把非天然修饰集中到末端或少数几个位点，用杂合路线生产。换句话说，AI 设计会反过来适配制造路线，而不是制造去追赶设计。

可以把上述推演压成一张情景表，前提是 2030 年前后一个新上市的多靶点分子的年产量在 1 到 5 吨之间。

情景	分子特征	占优路线	对产能投资的含义
加速线	多个 Aib、两条侧链、40 个残基以上	固相片段加酶法连接	固相反应器与色谱需求继续上升，DMF 用量下降
基准线	一到两个 Aib、一条侧链、30 到 40 个残基	全化学固相或杂合	与 2026 年的投资方向一致
管控线	设计阶段即约束为可表达长段	重组片段加化学片段	发酵产能重新增值，固相需求增速放缓

对中国产业链而言，这张表有一个直接推论。中国 30 多家在建或规划司美格鲁肽原料药产能的企业几乎全部押在全化学固相路线上，这在基准线情景下是对的，但在管控线情景下会面对发酵路线企业（甘李药业、通化东宝、联邦制药等胰岛素企业本就拥有酵母或大肠杆菌体系）的成本挑战。反过来，同时拥有发酵与固相两套体系的企业，在三条线上都有位置。第 16 章的产业链全图会标出哪些企业属于这一类。

第四个推论涉及本书的最大反例。orforglipron 这类口服小分子 GLP-1 受体激动剂用常规小分子化学生产，不需要上述任何一条路线。如果小分子拿走减重与糖尿病的主流市场，那么本章讨论的路线之争只在多靶点、偶联药物与长寿维护等小分子做不到的领域继续，总量会小于当前的外推。哪条路线占优的答案因此取决于一个制造之外的变量：多肽在终端市场上守住多大份额。

本章要点

重组法让细胞按 DNA 合成主链，成本低、规模大，但核糖体只认 20 种天然氨基酸，装不了 Aib 与脂肪酸侧链。
诺和诺德的司美格鲁肽走酵母前体加化学片段加缩合的杂合路线，学术技术经济模型给出的单位成本约 105 美元每克（500 千克每年规模）。
礼来的替尔泊肽走固相片段加液相缩合的全化学路线，优势是任意序列与平台复用，代价是溶剂消耗与 18 到 36 个月的产能周期。
两条路线最终单位成本差距估计在 1.5 到 3 倍，且随化学路线规模放大而缩小，生物法真正的护城河是监管档案而非成本。
化学酶法用可设计的连接酶拼接固相短片段，是设计层向制造层渗透的通道，2026 年尚无商业化 GLP-1 原料药采用。
Codexis 的 ECO 合成平台面向寡核苷酸而非多肽，其意义在于示范酶法替代固相合成可以走到 GMP 阶段。
在 AGI 基准线情景下，设计自由度上升利于化学法，需求量级上升利于重组法，最可能的结果是设计反向适配可杂合生产的约束。

与定位的关系

对资本而言，路线之争提示两个判断。一是不要把"发酵产能"与"固相产能"混为一谈，评估一家企业的 GLP-1 供应能力时要问它的路线是什么、非天然构件从哪里来、缩合与纯化的收率是多少；一家只有发酵罐的胰岛素企业并不自动具备做替尔泊肽仿制药的能力。二是酶法与杂合路线的技术持有者（连接酶设计公司、拥有重组前体工艺档案的原研）是"平台与监管路径"这一进攻端的组成部分，它们的价值在于降低化学路线的溶剂与规模瓶颈，而不是取代物理产能。

对事业而言，同时理解发酵放大与固相合成放大的人比只懂其一的人稀缺得多，而真正能把 AI 设计的连接酶从序列变成 GMP 级酶制剂、并写进原料药 DMF 的人，在全球范围内以十计。这是本书所说"AI 到 GMP 的翻译者"在制造路线层面的具体含义。

对个人而言，本章的直接用处是识别信息真伪：一个声称"生物合成、无化学残留"的司美格鲁肽产品，若不能说明 Aib 与 C18 侧链如何引入，就是在回避基本化学事实。本书不构成医疗建议，也不构成投资建议，但路线的化学约束是可以自己核对的。

第 14 章 重组表达与化学酶法：路线之争